LV (慢病毒(LV)的生产)

简介：

慢病毒的生产主要基于三质粒(核心质粒pLV-GOI/shRNA、辅助质粒psPAX2和pMD2G )共转染HEK293T细胞。其中核心质粒含有病毒的基本元件 5’LTR 和 3’LTR 以及外源目的基因。psPAX2质粒主要携带gag、pol、rev 基因，分别编码病毒主要的结构蛋白、特异性的酶以及调节 gag 和 pol 基因表达的调节因子。pMD2G 载体中含有vsvg 基因，为病毒包装提供所需要的包膜蛋白。

图1 慢病毒包装流程图

1 LV质粒构建

1）根据实验目的和受试细胞选择不同的rLV载体。一般通过简单酶切-连接-转化-测序的方式将目的基因克隆至LV表达载体，并验证载体表达功能。

2）为了获得高质量、高浓度且低内毒素含量的质粒，通过柱离心法及去内毒素试剂进行质粒DNA纯化。

图2 慢病毒核心质粒构建流程图

2 病毒包装

1.细胞准备

从液氮灌中取出冻存细胞，迅速放入37℃水浴锅中复苏，离心后向细胞中加入新鲜培养基，37℃、5%CO2条件下培养，每2-3天进行细胞传代；待细胞生长正常后转入10cm的培养皿中贴壁培养备用。

2.质粒转染

当细胞密度达到约80~90 %的汇合率即可进行转染，将转染三质粒体系按一定比例配置后，使用转染试剂(PEI max)将质粒转染到准备好的293T细胞中，按照每皿1000μL体系进行转染及培养，转染6h后更换新鲜培养基。(转染条件参考PEI max转染试剂使用方法)

3.细胞培养

培养一天后，通过显微镜观察细胞转染情况。

4.病毒收毒及除杂

培养48hr后，收集病毒上清并更换新鲜培养基继续培养，72hr后收集病毒上清，0.45μm滤膜过滤。

5.病毒纯化及浓缩

将过滤后的病毒上清进行超速离心4℃，25000rpm，2.5h后，离心后弃去上清，利用病毒保存液重悬病毒沉淀，4℃溶解并放置过夜。

6.病毒收集

收集病毒液并进行分装。

二、慢病毒（LV）质量检测

腺相关病毒的质量主要包括滴度检测、纯度检测、无菌检测、支原体检测及内毒素检测。

1 滴度检测

慢病毒的滴度单位为TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数，即感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。根据感染后目的基因的表达情况，可以换算单位体积中慢病毒的含量，即慢病毒的感染滴度。

1) 携带荧光标签的慢病毒滴度检测方法

a.细胞准备（day 1）
将293T细胞接种于96孔板，约3~5x104个目的细胞/孔，37℃、5%CO2条件下培养过夜，一般病毒感染时细胞的融合度约为70%左右为宜。

b.病毒稀释及感染（day 2）
利用细胞培养液将待检测慢病毒原液进行10倍梯度稀释，一般设置6~8组稀释度的病毒。可根据实验实际情况提高或者降低稀释倍数，调整病毒稀释组数。将稀释的病毒分别加入到准备好的293T细胞中孵育过夜，每个稀释度重复3个孔。

c.更换培养液（day 3）
病毒感染24小时内更换新鲜培养液后继续培养。

d.荧光计数及滴度计算（day 5）
通过显微镜观察孔内带有荧光的细胞数，每个稀释度样品重复3次，计算3个复孔带有荧光的细胞数的平均值。按照下列公式计算慢病毒滴度。假设A为倒数第二个可观察到荧光孔的荧光细胞平均值，B为倒数第一个可观察荧光孔的荧光细胞平均值。
滴度（TU/ml）=（A+10xB）x1000/2/A孔病毒量（uL）
检测标准：滴度≥1.0E+8 TU/mL
2) 无荧光标签的慢病毒滴度检测方法

a细胞准备（day 1）
将293T细胞接种于24孔板，约3~5x104个目的细胞孔，37℃、5%CO2条件下培养过夜，一般病毒感染时细胞的融合度约为70%左右为宜。

b病毒稀释及感染（day 2）
利用细胞培养液将待测慢病毒原液、已知TU的带荧光标签的慢病毒原液（实验对照组）分别进行10倍梯度稀释，一般设置3组稀释度的病毒。将稀释的病毒分别加入到准备好的293T细胞中孵育过夜，每个稀释度重复3个孔。

c更换培养液（day 3）
病毒感染24小时内更换新鲜培养液后继续培养。

d基因组DNA提取及滴度计算（day 5）
病毒感染72h后，收集细胞并进行基因组DNA的提取（可参考Takara基因组DNA提取试剂盒说明书）。利用特异性的引物进行荧光定量PCR实验，检测待测病毒样品的基因拷贝数，并利用对照组的基因拷贝数及TU值，换算无荧光标签的慢病毒滴度（TU/mL）值。每个样品重复3次，取3个复孔基因拷贝数平均值。按照下列公式计算慢病毒滴度。
滴度（TU/mL）=（待测样品基因拷贝数/对照组样品基因拷贝数）*对照组样品滴度
检测标准：滴度≥1.0E+8 TU/mL