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慢病毒 (lentivirus vector,LV)

简介:

慢病毒载体(lentivirus vector,LV)属 于 逆 转 录 病 毒 科 (Retrovidae),为 RNA病毒。区别一般的逆转录病毒载体,它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快,研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上,从而达到持久性表达。

感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞,从而达到良好的的基因治疗效果,在美国已经开展了临床研究,效果非常理想,因此具有广阔的应用前景。

优势:

慢病毒与其他病毒工具比较,具有以下优势:

  • 1) 表达时间长:慢病毒通过将外源基因整合到宿主细胞基因组上,可实现目的基因长时间稳定的表达,不随着细胞分裂传代而丢失,是细胞实验的首选;
  • 2) 安全性高:未发现致病性,已被用于CAR-T 治疗作用于人体;
  • 3) 免疫原性低: 直接注射活体组织不易造成免疫反应,适用于动物实验。

可选择的病毒载体

详情见:基因过表达、基因干扰

应用:

  • 将目的基因 /RNAi 基因转入难以转染的细胞,比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞;
  • 将目的基因 /RNAi 基因转入动物组织,以期获得长期表达;
  • 构建稳定表达目的蛋白 /RNAi 的细胞系,再用exvivo的方法导入动物体内;
  • 基因治疗;
  • 转基因动物; 
  • 基因敲除;
  • 药物研究:构建表达受体蛋白的细胞系,研究药物的作用; 
  • 快速建立生产目的蛋白的细胞系,非常有前途的真核细胞表达方法。

案例展示

案例一:慢病毒度感染不同类型的细胞系

  • 病毒类型及滴度:实验组AAV2/8/SmVEGF-2,对照组AAV2/8/GFP;3.00E+14 vg/mL
  • 感染动物及部位:C57BL/6 小鼠;视网膜下间隙
  • 实验方法及结果:

    将1μl siRNA实验组病毒(AAV2/8/SMVEGF-2;n=12)或对照载体(AAV2/8/gfp;n=14)注入C57BL/6小鼠的视网膜下腔。1week后,用半导体激光在每只眼的视神经周围制造4个不同的脉络膜烧伤,诱导脉络膜新生血管(CNV)。2week后,摘除眼睛进行视网膜平贴制剂CNV分析。

    结果显示,视网膜下注射AAV2/8/SmVEGF-2与AAV8/GFP相比,激光损伤区的CNV显著减少(1597.3±2077.2比5039.5±4055.9µm(2);P<0.05)。使用酶联免疫吸附试验,我们发现AAV2/8/SmVEGF-2治疗组的VEGF水平降低了大约一半。

图1. 慢病毒可以高效的感染各类肿瘤细胞、干细胞、原代细胞、和不分裂的细胞

图1. 慢病毒可以高效的感染各类肿瘤细胞、干细胞、原代细胞、和不分裂的细胞

案例二:LV介导基因沉默体外研究神经元棘突和突触功能

神经元细胞感染表达b-Catenin小发夹RNA (shRNA)的慢病毒,使大部分神经元敲除b-Catenin。b-Catenin敲低后,神经元细胞棘突稳定性受到破坏。

图2. 慢病毒携带shRNA介导b-Catenin敲减(Li MY et al., Neuron, 2017)

图2. 慢病毒携带shRNA介导b-Catenin敲减(Li MY et al., Neuron, 2017)

案例三:LV介导基因沉默在体研究中间神经元电偶联

将LV-shRNA病毒注射到新生P1小鼠的硬脑膜和皮质层P1的间隙(e.f),P15小叔中观察到GFP+主要分布在L1,在深层的分布较少。

图3. 诱导型慢病毒shRNA有效介导Connexin36敲减 (Xinghua Yao et al.,Nat Commun,2017)

图3. 诱导型慢病毒shRNA有效介导Connexin36敲减 (Xinghua Yao et al.,Nat Commun,2017)

案例四:光遗传学应用

慢病毒可以携带光感基因(ChR2、eNpHR3.0等)感染神经元细胞,实现靶基因的高效表达。

图4. LV携带光敏基因的应用(Feng Zhang, Viviana Gradinaru., et al. Nature protocols,2010)

图4. LV携带光敏基因的应用(Feng Zhang, Viviana Gradinaru., et al. Nature protocols,2010)

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