大脑神经网络是由数目庞大，以及形态、功能各异的神经元，通过突触连接构成的复杂结构，是大脑行使认知、情感、记忆及想象等活动的结构基础。提示大脑神经网络的结构是理解大脑处理信息的机制的前提，传统的示踪方法促进了人们对大脑神经网络结构的认识，但难以用于研究多个脑区、多种类型神经元通过突触连接形成复杂的神经网络，这类神经网络才是大脑处理特定信息所依赖的环路。
解析大脑不同脑区、不同类型神经元之间的神经环路连接是神经科学研究的重要任务之一，绘制大脑连接体图对于理解大脑如何工作是至关重要的，病毒工具是目前最为有效、应用最广的神经环路示踪工具。神经回路是神经功能的基本单位，是连接大尺度（结构/功能）和小尺度（分子/信号通路）的桥梁，有效地绘制神经回路需要逆行和顺行示踪病毒同时传输多级或单级突触。目前，顺向跨多级的病毒载体工具有单纯疱疹病毒（HSV）和水疱炎病毒（VSV）。
图1. 神经元顺向跨多级标记示意图
H129为HSV-1型病毒的临床分离株，在外周神经系统以及中枢神经系统都具有严格顺向跨突触的特性。病毒感染神经细胞后，在胞内复制并表达目的基因，子代病毒经轴突运输到突触前，跨突触进入下游神经元，开始新一轮的复制及跨突触传播等过程。经过改造的病毒，装入荧光蛋白以后可以实现高效、稳定的顺行跨突触标记神经元网络，适合于神经输出环路的顺行示踪研究。
将rH129-EGFP注射到小鼠腹侧被盖区（VTA），观察到rH129-EGFP顺行跨多级到海马（Hippocampus）、中缝背核（DR）、杏仁核背内侧核前段（BMA）、脚内核（EP）、下丘脑（Hypothalamus）和鼻外皮层（Ect）。
图2. 利用rH129-EGFP标记小鼠腹侧被盖区（VTA）的输出神经环路
实例一：R-NG的顺向跨多级病毒示踪
图3. 迷走神经中枢通路的标记（HanW,et al.,Cell,2018）
VSV病毒具有特异顺向跨突触的特性。当病毒定位注射到实验区域，病毒感染神经细胞后在神经细胞内复制并表达携带的荧光蛋白基因，子代病毒产生后经轴突运输到突触前，跨突触进入下游神经元，并开始新一轮的复制、包装及跨突触传播等过程。用于顺向跨突触示踪的VSV工具病毒，在大/小鼠动物模型中的神经回路示踪研究中广泛使用。它也能感染多种动物模型，包括鱼类、禽类，及非人灵长类等。其特点是复制及跨突触速度快，外源基因表达量超高，可获得神经元精细形态。
如将VSV-EGFP注射到C57小鼠Spleen区域，在大脑中枢ARC、DMH、PIRI区域检测到荧光信号，表明VSV-EGFP顺行跨多级到了这三个核团。
图4. 将VSV-EGFP注射到小鼠Spleen区域的输出神经环路
实例一：OB的顺向跨多级病毒示踪
图5. 嗅球(OB)对基底前脑（BF）的输入网络（ZhengY,et al.,Front Neural Circuitsl,2018）
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