AAV (rAAV生产)

简介：

重组腺相关病毒的生产主要基于三质粒(核心质粒pAAV-GOI/shRNA、血清型质粒pAAV-RC、辅助质粒pHelper)共转染HEK293T细胞。包装细胞反式提供rAAV的结构蛋白Cap及功能蛋白Rep，并在辅助质粒pHelper的帮助下，高效地将带有ITR的目的DNA片段包装到包装到rAAV病毒颗粒中。

图1 rAAV的生产流程

1 rAAV载体构建

1）根据实验目的和受试细胞选择不同的rAAV载体。一般通过简单酶切-连接-转化-测序的方式将目的基因克隆至rAAV表达载体，并验证载体表达功能。

2）为了获得高质量、高浓度且低内毒素含量的质粒，通过柱离心法及去内毒素试剂进行质粒DNA纯化。

图2 rAAV核心质粒构建流程图

2 rAAV 病毒包装

1细胞准备

从液氮灌中取出冻存细胞，迅速放入37℃水浴锅中复苏，离心后向细胞中加入新鲜培养基，37℃、5%CO2条件下培养，每2-3天进行细胞传代；待细胞生长正常后转入10cm的培养皿中贴壁培养备用。

2质粒转染

当细胞密度达到约80~90 %的汇合率即可进行转染，将转染三质粒体系按照一定比例配置后，按照每皿1000μL体系进行转染及培养。

3细胞培养

培养一天后，通过显微镜观察细胞转染情况。一般情况下需转染效率在80%以上，转染率过低会导致病毒产量下降。

4病毒收毒及除杂

培养72hr后，收集病毒上清。将病毒培养上清液低温离心去除细胞碎片，并加入适量核酸酶，37℃去除游离的核酸，然后加入PEG8000/NaCl溶液过夜聚沉。

5病毒纯化及浓缩

将聚沉的病毒用PBS进行重悬并置于超速离心机进行密度梯度离心；离心后，抽取病毒对应层的溶液，利用透析袋进一步4℃透析过夜；第二天将透析液0.22um过滤，并通过浓缩管进行浓缩和清洗，达到除杂和浓缩的目的。

二、rAAV质量检测

腺相关病毒的质量主要包括滴度检测、纯度检测、无菌检测、支原体检测及内毒素检测。

1 滴度检测

• 检测方法：完整的rAAV病毒粒子含有1个拷贝的基因组DNA，将病毒样品进行酸碱裂解处理，使其暴露出基因组DNA。进一步利用特异性的引物进行荧光定量PCR实验，检测rAAV病毒粒子的DNA拷贝数，即rAAV的数量VG（Viral genomes），换算成单位体积中rAAV的含量，即rAAV的滴度VG/mL（Viral genomes/mL）。
• QC标准：滴度≥1.0E+12 VG/mL

2 纯度检测

• 检测方法：利用SDS-PAGE方法对病毒样品进行纯度检测。
• QC标准：银染染色结果中，只有VP1 、VP2 、VP3 三种蛋白的染色条带，亮度比约为1:1:10且无明显杂带。

3 无菌检测

• 检测方法：将病毒样品接种到适于各菌生长的培养基中，37℃培养7天后，检测细菌和真菌的生长情况。
• QC标准：培养基需澄清透明，无任何细菌及真菌污染。

4 支原体检测

• 检测方法：利用支原体16S rRNA基因的保守区设计引物，通过凝胶电泳和荧光定量检测病毒样品中有无支原体的污染。
• QC标准：PCR胶图无条带。

5 内毒素检测

• 检测方法：按照内毒素检测鲎试剂盒（试管定量显色基质法）使用说明书进行操作。
• QC标准：＜10EU/ml