大脑存在数量众多而功能异质的神经元，在响应刺激输入时，特定的神经元类群集结成印迹, 构成细胞和环路水平的功能编码单元。为了解析这些功能编码单元，IEG表达作为神经元激活的间接表征被广泛应用，但是从神经元激活到IEG表达需要经历一系列细胞电化学活动，使其时间分辨率和活动表征灵敏性远不足即时标记高速变化的神经系统。2017年，Wang等人开发FLARE工具，它是一种新型的光和钙依赖性神经元活动标记系统，能够在急性实验时间窗口内对特定激活的神经元进行遗传标记[1]。相比较TRAP2和RAM等使用药物作为诱导剂的系统，scFLARE2系统能够快速响应神经元活动，其时间窗口为1至30分钟。
FLARE工具基于蛋白互作系统Tango的模块式基因表达结构、GECIs的钙检测以及向光素光氧电压结构域（LOVs）的光反应特性, 实现了高时间空间分辨率的光控钙离子依赖的活性神经集群标记及目的基因的表达。
他们将钙调蛋白（CaM）和CaM结合肽M13/M2两个GECIs的组分替换了Tango系统中的GPCR和β-arrestin，并将转录因子tTA通过烟草蚀刻病毒蛋白酶体（TEV Protease, TEVp）的酶切序列与其中的一个组分连接栓系在细胞膜上，而将另一组分与TEVp融合，当胞内Ca2+浓度升高时，CaM与Ca2+结合引发构象变化从募集M13/M2，使得两个分离的结构模块靠近，此时给予蓝光照射引发LOVs构象变化使得掩藏的TEVp酶切位点暴露出来，随后TEVp的酶切反应将tTA从膜上释放出来，入核启动目的基因的表达从而实现光控Ca2+依赖的活性标记。
多伦多大学的Sheena A Josselyn研究团队于2023年12月15日在Cell reports期刊上发表题为“Examining memory linking and generalization using scFLARE2, a temporally precise neuronal activity tagging system”的研究论文[2]。研究人员通过在外侧杏仁核(LA)注射AAV-scFLARE2和AAV-TRE-mCherry病毒表达4周，借助声调条件刺激（CS）和脚电击无条件刺激（US）的配对训练，使得声调能够引发小鼠的恐惧反应，同时在训练期间接受持续时间（3或10min）和频率（0.25或20 Hz）蓝光（BL），24小时后进行记忆测试，用cFos免疫染色鉴定记忆提取过程中活跃的神经元。结果表明，即使在训练期间只应用3分钟的BL，scFLARE2也能有效地标记活跃的LA神经元。这一发现与基于即刻早期基因（IEG）的标记系统相比，显示出更短的时间窗口。
图1 使用scFLARE2标记在单一威胁记忆实验中活跃的外侧杏仁核神经元
然后，研究人员又通过使用scFLARE2和TRE-eNpHR3.0-mCherry，在听觉威胁训练期间给予BL标记活性神经元，在测试期间再次给予红光（RL），使得scFLARE2标记的神经元表达RL敏感的抑制性视蛋白eNpHR3.0，测试期间活跃的神经元用cFos免疫组织化学鉴定。结果发现，对scFLARE2标记神经元的RL抑制减少了cFOS的表达，破坏测试期间记忆的提取。
图2 通过光遗传功能性验证在单一威胁记忆实验中scFLARE2的有效标记
2024年11月15日，加州大学神经科学系C. K. Kim研究团队在Science杂志上发表文章“Isolation of psychedelic-responsive neurons underlying anxiolytic behavioral states”[3]。研究人员通过GRIN透镜结合钙离子成像实验发现致幻剂2,5-二甲氧基-4-碘苯丙胺（DOI）注射后可以立即增加mPFC脑区约54%神经元放电活动的增加。为进一步了解DOI激活的神经元群的转录组学特征，研究人员通过给小鼠mPFC注射AAV-scFLARE2和AAV-TRE-GFP，并植入用于蓝光递送的光纤套管，用于标记DOI激活的mPFC神经元。用DOI或盐水治疗小鼠，并立即传递蓝光刺激15分钟，以驱动激活神经元的scFLARE2标记，24小时后处死小鼠进行组织学分析，结果发现注射DOI的小鼠比注射盐水的对照小鼠表达更多的GFP+细胞，DOI处理的小鼠中约40%的scFLARE2表达细胞被激活。
图3 利用scFLARE2标记DOI激活的神经元
重激活DOI标记的神经元是否具有抗焦虑作用，研究人员利用scFLARE2标记DOI激活的神经元，并在mPFC脑区注射兴奋性光遗传学病毒AAV-TRE-bReaChES。结果发现与盐水组相比， DOI组小鼠在治疗30分钟后埋珠行为减少，这种效果没有持续到第二天。然而，在第2天光激活DOI标记的神经元后，小鼠的埋珠行为显著减少；EPM中小鼠在开放臂上花费的时间也显著增加。这些结果表明，给药24小时后光刺激mPFC中DOI激活的神经元足以再现药物的急性抗焦虑作用。
图4 重激活DOI标记的神经元在不引起致幻状态下发挥抗焦虑作用
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参考文献：
[1] Wang W, Wildes CP, Pattarabanjird T, Sanchez MI, Glober GF, Matthews GA, Tye KM, Ting AY. A light- and calcium-gated transcription factor for imaging and manipulating activated neurons. Nat Biotechnol. 2017 Sep;35(9):864-871. doi: 10.1038/nbt.3909. Epub 2017 Jun 26. PMID: 28650461; PMCID: PMC5595644.
[2] Jung, J. H., Wang, Y., Rashid, A. J., Zhang, T., Frankland, P. W., & Josselyn, S. A. (2023). Examining memory linking and generalization using scFLARE2, a temporally precise neuronal activity tagging system. Cell reports, 42(12), 113592. https://doi.org/10.1016/j.celrep.2023.113592
[3] Muir J, Lin S, Aarrestad IK, Daniels HR, Ma J, Tian L, Olson DE, Kim CK. Isolation of psychedelic-responsive neurons underlying anxiolytic behavioral states. Science. 2024 Nov 15;386(6723):802-810. doi: 10.1126/science.adl0666. Epub 2024 Nov 14. PMID: 39541450.
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