Cell︱精准控制疼痛：HCAD系统革新外周化学遗传学

发布时间：2025-01-05 22:44:50

疼痛，是我们身体的一种保护机制，但慢性疼痛却严重影响着许多人的生活质量。传统止痛药物往往作用于全身，包括大脑，这可能导致一系列副作用。因此，科学家们一直在寻找更精准的疼痛控制方法。2024年12月03日，北卡罗来纳大学Bryan L. Roth教授团队在Cell杂志发表了题为“Structure-guided design of a peripherally restricted chemogenetic system”的研究论文，该团队开发了HCAD系统，这是一种基于羟基羧酸受体2（HCA2）的DREADD化学遗传工具。通过特定的化学激活剂FCH-2296413，HCAD系统能够精确作用于身体周围的神经，特别是背根神经节（DRG）中的痛觉感受器，从而减轻疼痛。这种系统的设计目的是避免药物穿过血脑屏障，从而实现对周围组织的精确控制。

基于外周HCA2受体的DREADD

之所以选择HCA2受体作为DREADD系统的模板，是因为HCA2受体在大脑和其他神经组织中的表达量很低，而在先天免疫细胞中表达较多，这些免疫细胞主要位于屏障组织。由于HCA2在神经元中的表达量低，使用针对HCA2的药物可以减少对大脑神经元的潜在影响，从而降低副作用。MK-0354是一种HCA2 Gi偏向性激动剂，虽然其效果不佳未能进入第二阶段临床试验，但这样的低效或无效配体适合作为DREADD系统中潜在化学遗传激活剂。研究人员不仅对HCA2受体进行了突变，创建了HCAD，并筛选出了具有更高效能和选择性的化学激活剂FCH-2296413。

图1 HCAD系统原理示意图

HCAD外周神经调节功能验证

大多数急性、围手术期和慢性疼痛是由DRG的外周初级传入神经元驱动的。因此，减少DRG神经元的活动，特别是痛觉感受器的活动，是开发先进疼痛治疗方法的主要策略。为了验证HCAD DREADD在体内的实用性，研究人员生产了一种腺相关病毒（AAV），用来感染DRG痛觉感受器并以Cre重组酶依赖的方式表达mHCAD-mCitrine（PHP.S-CAG-FLEx-mHCAD-mCitrine）。在Avil-Cre和TRPV1-Cre新生（P2）小鼠腹腔或成年小鼠鞘内注射AAV病毒，分别标记DRG神经元和DRG痛觉感受器。病毒注射后成功地在Cre+ DRG神经元中表达mHCAD-mCitrine（图2A）。

在细胞水平上使用全细胞膜片钳技术在分离的背根神经节（DRG）神经元中验证了mHCAD-mCitrine的功能。在DRG神经元中，Gi信号通常抑制电压门控钙通道（VGCCs），减少神经递质的释放以及从外周神经系统（PNS）到脊髓和大脑的体感信息（包括疼痛信息）的传递。在Avil-Cre小鼠的DRG神经元中，FCH-2296413以浓度依赖性的方式减少了HCAD-mCitrine阳性神经元中电压激活的钙电流幅度。在100 nm的浓度下，FCH-2296413没有产生任何抑制作用，1和10 μm的FCH-2296413显著抑制了VGCC（图2B和2C）。此外，在给FCH-2296413后钙电流动力学变慢（图2B和2D）。这些抑制作用与作用于DRG神经元内源性Gi-GPCRs的阿片类镇痛药产生的效果非常相似。在mHCAD-mCitrine阴性（对照）神经元中FCH-2296413对VGCCs没有抑制作用。

图2 全细胞膜片钳技术记录电压激活的钙电流

Gi信号的另一个典型效应是膜电位的超极化，这导致兴奋性降低和体感信息的编码。研究发现FCH-2296413显著降低了mHCAD-mCitrine+DRG神经元的静息膜电位（RMP）（图3E和3F），并减少了动作电位（APs）（图3E和3G）。这些影响是可逆的，因为在清洗FCH-2296413后，RMP和AP都恢复到基线水平（图3F和3G），并且在mHCAD-mcitrine阴性的对照神经元中没有出现这种现象（图3F和3G）。

图3 mHCAD系统对静息电位和动作电位影响

此前有报道称，在没有激动剂的情况下hM4Di的表达会改变DRG神经元离子通道的功能。因此，为了进一步表征mHCAD的功能及其在研究外周神经元方面的潜在优势，研究人员验证了在没有FCH-2296413的情况下，mHCAD表达对参与AP形成的电流的影响，结果发现AP波形（图4H-4M）的阈值、过冲（Overshoot，动作电位达到峰值时，膜电位超过正常静息电位的值）和持续时间方面没有显著差异（图4I-4K）。这表明，负责APs起始、上升和下降阶段的电压门控钠通道和电压门控钾通道不受mHCAD表达的影响。然而，mHCAD的表达一定程度上增加了超极化后AP的振幅，但没有增加其衰减时间（AHP）（图4L和4M）。最重要的是，mHCAD-mCitrine+细胞和不表达受体的细胞之间的兴奋性没有差异（图4N）。另外，与hM4Di相比，mHCAD的表达没有引起任何可检测到的基因表达变化（图4O）。综上所述，在FCH-2296413缺失的情况下，mHCAD表达对DRG神经元功能的影响有限，而FCH-2296413激活mHCAD影响了DRG神经元中与兴奋性降低和递质释放相关的经典Gi信号通路。

图4 mHCAD对参与AP形成电流影响

在DRG痛觉感受器中HCAD的激活可以减轻疼痛

研究人员评估了FCH-2296413（10mg/kg，皮下注射）对鞘内注射PHP.S-CAG-FLEx-mHCAD-mCitrine或对照病毒PHP.S-CAG-FLEx-tdTomato（Ctrl）的Trpv1-Cre小鼠痛觉的影响（图5A和5B），结果显示在急性热痛的热板测试中（图5C），FCH-2296413显著减少了DRG痛觉感受器表达mHCAD小鼠的前爪舔、后爪舔和跳跃的持续时间和次数，以及这些伤害性行为的总次数，同时增加了首次伤害性行为的潜伏期（图5C），提示mHCAD介导镇痛作用。此外，在组织损伤和慢性炎症性疼痛的Freund’s adjuvant（CFA）模型中（图5D），FCH-2296413减轻了表达mHCAD小鼠的机械性和热性痛觉过敏，但在对照小鼠中没有减轻，从而确立了FCH-2296413和mHCAD的治疗性抗痛觉过敏特性。总体上证实了在DRG痛觉感受器表达mHCAD的小鼠中FCH-2296413对生理性和病理性疼痛都具有镇痛活性。

图5 mHCAD外周化学遗传的镇痛作用

已有报道提出其他化学遗传学药物（如CNO）可以改变小鼠的运动行为，这可能会混淆对许多行为的解释，包括伤害性反应。接下来研究人员探究了在未表达mHCAD的WT小鼠中，FCH-2296413对各种行为的影响（图6H-6P）。结果发现FCH-2296413对WT小鼠机械阈值没有影响，在尾巴浸没测试（图6I）、热板（图6J和6K）和哈格里夫斯试验中没有引起伤害性行为的变化。不仅如此，研究人员还检验了FCH-2296413对旷场测试中的运动和焦虑行为，以及转棒测试中的运动协调性的影响。在这些实验中，FCH-2296413对WT小鼠的行为没有影响。综上所述，这些结果表明，本文提出的外周DREADD系统可以特异性地调节DRG痛觉感受器的功能并减轻疼痛，可用于外周神经元功能的机制研究和影响PNS的疾病的治疗。