小布解读 | 一文带你了解稳转细胞系的构建
发布时间：2024-11-08 16:55:48
导言：在生物医学研究与药物开发中，细胞模型作为不可或缺的基础工具，扮演着至关重要的角色。其中，稳转细胞系——特指那些能够长期稳定表达外源基因的细胞模型，凭借其卓越的基因或蛋白质持续表达能力，已成为科研探索中不可或缺的重要资源。构建稳转细胞系是生物技术领域中的一项重要技术，它在药物开发、基因功能研究以及疾病模型构建等方面发挥着重要作用。接下来跟小布一起学习构建稳转细胞系的原理、方法及其在理论研究中的应用吧！
稳转细胞系的构建基于基因工程和分子生物学两个学科的技术手段，通过将外源DNA克隆到具有某种抗性的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到宿主染色体中，用载体中所含的抗性标志进行筛选混合阳性克隆（针对转染效率较高的细胞株），最终使得外源DNA能够在细胞分裂过程中被稳定地遗传和表达。
1.目的基因的选择与克隆：根据研究目的，选择合适的基因序列，并将其克隆到具有某种抗性的表达载体中，最常用的表达载体抗性筛选标志物有新霉素（Neomycin）、杀稻瘟菌素（Blasticidin）、嘌呤霉素（Puromycin）、遗传霉素G418（Geneticin）。
2.载体设计：设计能够整合到宿主细胞基因组中的表达载体，通常包含启动子、增强子、选择标记等元件。
3.转染：利用物理或化学方法将表达载体导入宿主细胞，使其具有表达外源基因的能力。
4.筛选与鉴定：通过抗生素筛选或其他筛选标记，初步筛选成功整合外源基因的阳性细胞，并进行RNA及蛋白水平的鉴定，进一步确认稳转细胞系的成功构建与功能表达。
1.质粒介导的细胞转染
瞬时转染是指携带外源DNA的质粒或其他载体在细胞内以非整合状态存在，只在一段时间内表达其携带的基因，常通过短暂的基因表达进行基因功能研究，普通载体骨架的质粒如pcDNA3.1、pUC57即可满足需求；而稳定转染则需将外源基因整合到宿主细胞的基因组中，以实现长期稳定的基因表达。稳转细胞系需借助基因编辑技术进行构建，主要包括以下2种技术：
DNA转座子技术：在自然界中，DNA转座子系统包含转座酶，该酶负责识别并催化转座子在基因组中的移动，其编码序列两端具有末端反向重复序列（TRs）。转座酶可在TRs位点和基因组位点引入双链断裂，从而使整个转座子区域发生转位。对于基因编辑应用，可以将转座酶组分进行分离，一个辅助质粒：编码转座酶；一个转座子质粒：含优化的两端TRs，中间是被转座区域，可插入我们想转座到宿主基因组中的目的基因序列。常用的转座系统包括：PiggyBac、睡美人（Sleeping Beauty）和Tol2，其特点见下表。
其中，PiggyBac是最受欢迎的转座子系统之一，可用于递送转基因、shRNA、重组抗体等。PiggyBac转座子在发现后经过了一系列优化和改造，优化后的转座酶（hyPBase）使转座效率进一步提高，具有剪切活性但是整合活性缺失，确保在移除整合的序列后，该位置不会再次被转座子重新插入，实现无痕剪切。此外，PiggyBac转座子的一个显著优势在于其大装载量，可以在5’和3’ TR之间携带长达27 kb的DNA。PiggyBac转座子介导基因整合时会在染色体TTAA位点切割DNA，并且优先选择基因内区域。以PiggyBac系统为例，具体的整合过程如下图所示：
CRISPR/Cas9技术：CRISPR/Cas9属于CRISPR系统中的II型，对于外源基因的剪切只需要一个剪切蛋白（Cas9蛋白），因其设计及操作相对简单，在基因编辑中得到了广泛应用，可以实现目的基因的敲除（knock out）、敲入（knock in）和转录激活。
在构建基因敲除稳转细胞系时，首先进行质粒的结构设计，其中包括向导RNA（sgRNA，靶向目的基因）、Cas9酶基因、EGFP或其他标记蛋白等。质粒转染细胞后会在细胞内发挥基因编辑作用：在sgRNA的引导下，Cas9核酸内切酶会在PAM序列紧邻上游（即5'端）的特定位置切割DNA双链，导致DNA双链断裂。
图2 Cas9作为基因编辑工具在细胞中的应用[2]
（左：细胞系；中：受精卵；右：在体细胞）
2.慢病毒介导的细胞感染：直接使用质粒转染并筛选的方法是最早采用的细胞系构建方案之一，但这种方法效率相对较低且稳定性较差。相比之下，慢病毒几乎可以感染所有类型的细胞（在分裂和不分裂的细胞），并且能够将遗传物质高效地整合到宿主细胞基因组中，实现长时间的稳定表达。由于其感染效率高、操作简便等优点，慢病毒介导的方法已成为目前构建稳转细胞株的主流技术。
慢病毒介导的稳转细胞株构建主要分为三大步：慢病毒表达载体构建、慢病毒包装及稳转细胞株构建。
1.长期稳定表达：稳转细胞系能够在长时间内稳定表达外源基因，这为长期实验及科研研究提供便利，且大部分用于科研实验的细胞可稳定重复传代。
2.重复性和准确性：稳转细胞系的遗传背景一致，可提供高度的实验重复性和结果的准确性。
3.功能研究：稳转细胞系可用于深入研究特定基因的功能，通过稳定表达目的基因，进而研究其在细胞生理和病理过程中的作用。
4.基因编辑验证：稳转细胞系可用于验证基因编辑技术的效果，如CRISPR/Cas9等，通过稳定表达报告基因来评估编辑效率。也可通过CRISPR/Cas9技术实现基因的敲除、敲入、转录激活或抑制从而进行基因的功能探究。
5.疾病模型构建：稳转细胞系可用于模拟疾病相关的基因表达变化，构建疾病模型，为疾病机理研究和治疗策略开发提供平台。
6.药物筛选和开发：在药物筛选中，稳转细胞系可以作为模型系统，用于高通量筛选和评估化合物的药效和安全性。
7.生产生物制品：在生物技术产业中，稳转细胞系可用于生产重组蛋白、抗体和其他生物制品。
案例一
2021年12月，重庆医科大学附属儿童医院吴盛德课题组在Journal of Hazardous Materials发表了“Di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure leads to ferroptosis via the HIF-1α/HO-1 signaling pathway in mouse testes”一文[3]。文章研究了环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）对小鼠睾丸的损伤作用，特别是其诱导的铁死亡现象。研究发现，围产期DEHP暴露导致小鼠血清中DEHP及其主要代谢产物MEHP浓度升高，利用RNA测序等技术揭示了铁死亡和HIF-1信号通路在DEHP诱导的睾丸损伤中的潜在作用。文章中通过CRISPR/Cas9技术构建了敲除Hif-1α基因的TM3 Leydig和TM4 Sertoli细胞系，证实了HIF-1α在DEHP诱导的铁死亡中发挥关键作用，其敲除可逆转由MEHP诱导的铁死亡。论文研究结果为理解DEHP诱导的睾丸损伤机制提供了新的见解，并指出了HIF-1α/HO-1信号通路在其中的重要性。
图4 HIF-1α基因敲除挽救了MEHP诱导的铁死亡
案例二
2023年5月，南方医科大学郑磊教授、第四军医大学郝晓柯教授团队在Journal of Experiment and Clinical Cancer Research发表“miR-92a-1-5p enriched prostate cancer extracellular vesicles regulate osteoclast function via MAPK1 and FoxO1”一文[4]。该论文在前期研究基础上，探究前列腺癌细胞来源的细胞外囊泡（EVs）特别是富集miR-92a-1-5p的EVs在调控破骨细胞功能方面的作用及其分子机制。文章通过构建miR-92a-1-5p过表达的前列腺癌细胞系（MDA PCa 2b），并发现这些工程化的EVs能够通过降低MAPK1和FoxO1的表达来促进破骨细胞的分化，与体内外骨吸收功能的增强有关。同时，体内实验也证实了miR-92a-1-5p富集的EVs能够促进骨质疏松。这些发现表明，miR-92a-1-5p富集的EVs可能通过MAPK1和FoxO1调控破骨细胞功能，为治疗骨疾病提供了新的视角和潜在的治疗策略。
图五 成功构建miR-92a-1-5p过表达稳转MDA PCa 2b细胞系
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参考文献：
[1]Mitra R, Fain-Thornton J, Craig NL. piggyBac can bypass DNA synthesis during cut and paste transposition. EMBO J. 2008 Apr 9;27(7):1097-109.
[2]Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 2014 Jun 5;157(6):1262-1278.
[3]Wu Y, Wang J, Zhao T, Chen J, Kang L, Wei Y, Han L, Shen L, Long C, Wu S, Wei G. Di-(2-ethylhexyl) phthalate exposure leads to ferroptosis via the HIF-1α/HO-1 signaling pathway in mouse testes. J Hazard Mater. 2022 Mar 15;426:127807.
[4]Yu L, Sui B, Zhang X, Liu J, Hao X, Zheng L. miR-92a-1-5p enriched prostate cancer extracellular vesicles regulate osteoclast function via MAPK1 and FoxO1. J Exp Clin Cancer Res. 2023 May 2;42(1):109.
