小布解读｜看大佬如何利用CRISPR筛选研究神经退行性疾病

2022年10月，斯坦福大学Aaron D. Gitler教授在Cell Reports发表“Genome-wide CRISPR screen reveals v-ATPase as a drug target to lower levels of ALS protein ataxin-2”的研究工作，该研究通过全基因组CRISPR敲除结合流式细胞分选技术（FACS），筛选发现多个调控共济失调基因2（ATXN2）蛋白水平的关键基因，并通过一系列的体内体外实验验证了筛选结果中编码溶酶体囊泡ATP酶（v-ATP酶）成分的基因可以调节内源性ATXN2的蛋白水平。多种FDA批准的v-ATP酶小分子抑制剂有效降低了小鼠和人类神经元中的ATXN2的蛋白水平，并且口服这些药物中的一种（如etidronate）可以降低小鼠大脑中ATXN2的蛋白水平。

背景介绍

Ataxin-2（ATXN2）是一种RNA结合蛋白和应激颗粒组装的调节因子，与多种神经退行性疾病的发病机制相关，其中ATXN2基因1号外显子的CAG三核苷酸重复扩增拷贝数>32次是脊髓小脑共济失调2型（spinocerebellar ataxia type 2，SCA2）病致病原因。研究表明，未达到 SCA2 阈值的ATXN2基因中间重复扩增是肌萎缩性侧索硬化症 （amyotrophic lateral sclerosis，ALS）的危险因素。并有研究指出携带ATXN2基因中间重复扩增的ALS患者发病年龄更早、生存时间更短。

目前，一种使用反义寡核苷酸靶向ATXN2降低其蛋白水平的治疗策略已进入人体临床试验。开发新型的更安全更便宜的降低ATXN2蛋白水平的治疗方法，能够为患者提供更多的治疗选择以及减少不良反应。同时，还能够帮助我们理解ATXN2蛋白的正常调控过程。

ALS症状相对于SCA2症状的时间变化取决于ATXN2扩展的长度

研究思路

• 1. 作者开发了一种基于CRISPR-Cas9和FACS的全基因组筛选方法，并结合测序确定影响ATXN2内源性蛋白水平的候选基因。
• 2. 对部分候选基因逐一验证，分别对各候选基因进行敲除，检测内源性ATXN2蛋白水平的变化。
• 3. 验证候选基因的小分子抑制剂是否能够达到同样的效果，降低ATXN2的蛋白水平。
• 4. 动物水平验证候选基因的小分子抑制剂同样能够降低ATXN2的蛋白水平。

实验内容

作者通过构建的CRISPR-Cas9和FACS联用的全基因组筛选方法，分选出ATXN2蛋白水平发生明显上调和下调的细胞库，对这部分细胞库进行二代测序发现影响ATXN2内源性蛋白水平的候选基因。两次实验均筛选到基因在火山图中分别以蓝色（下调ATXN2的蛋白水平）和红色（上调ATXN2的蛋白水平）表示出来。

为了进一步验证筛选系统的可行性，作者通过siRNA敲低筛选出的候选基因，检测ATXN2蛋白水平的变化。验证筛选出的候选基因的确能够影响ATXN2的蛋白水平。

对筛选出的候选基因按功能和亚细胞定位进行分类，作者发现敲除一系列v-ATP酶（ATP6V0C，ATP6V1A，ATP6V1B2，ATP6V1C1，ATP6V1D）都会降低ATXN2的蛋白水平。并通过siRNA敲低的方式进行了蛋白水平上的验证，v-ATP酶的敲除只影响ATXN2的蛋白水平但是不影响mRNA的水平，暗示着v-ATP酶的敲除影响了ATXN2蛋白的降解。（作者并没有解释是通过蛋白酶体还是溶酶体发生的降解）

v-ATP酶是真核生物细胞内膜系统中发现的ATP水解驱动质子泵，主要通过水解ATP产生的能量维持氢离子转运，从而产生跨膜电化学梯度并实现生物膜内外PH值调节作用。不同亚基功能异常可导致多种疾病类型，比如ATP6V0A4、ATP6V1B1基因突变引起远端肾小管酸中毒，ATP6V1C1、ATP6V1B2、ATP6V0A3、ATP6V0D2基因突变则导致骨发育及代谢方面的疾病，而ATP6V1C1在乳腺癌的发病机制中发挥一定作用。也有研究证明 ATP6V0A4、ATP6V1B2基因突变常伴随严重的感音神经性耳聋。随着神经生物学研究的日益深入，v-ATP酶在神经系统性疾病中的作用也逐渐受到关注。

利用CRISPR-Cas9技术，构建ATP6V1A敲除的细胞系，通过检测蛋白水平和免疫荧光的手段，ATP6V1A敲除的确减低ATXN2的蛋白水平。

为了找到能够通过调控v-ATP酶的功能影响ATXN2蛋白水平的小分子抑制剂，作者找到三个FDA批准的药物（Etidronate，Alendronate 和 Thonzonium，前两者作为双磷酸盐类，其与无机焦磷酸的相似性导致其可以抑制v-ATP酶的活性，后者通过解除v-ATP酶质子泵的质子运输和ATP酶活性的联接来发挥抑制作用），Etidronate由于其较好的安全性，作者对其进行了进一步的研究。

使用Etidronate处理两种不同方式来源的原代神经元细胞能够明显下调ATXN2的蛋白水平，并具有明显的剂量依赖效应。

使用Etidronate处理同样能够缓解亚砷酸盐诱导所形成的应激颗粒。

小鼠口服Etidronate一周后，能够明显降低大脑皮层中ATXN2的蛋白水平。

如同作者在讨论部分所提及的，该研究仍有一定的局限性，虽然观察到小鼠口服Etidronate后ATXN2蛋白水平的下降，但是Etidronate能否缓解相应的运动障碍以及神经退行性相关的表型仍不清楚。因为在作者另一篇文章中发现，相应的小鼠模型（TDP-43Tg/Tg）在未能够独立进食之前已发生死亡，所以限制了Etidronate的使用。不过，介于Etidronate能够很好的降低体内ATXN2的蛋白水平，作者相信Etidronate能够作为新的治疗药物在ALS或SCA2中发挥作用。

总之，本文提出v-ATP酶是肌萎缩性侧索硬化症和脊髓小脑共济失调2型的药物靶点，并证明了基于CRISPR-Cas9和FACS的筛选体系在鉴定疾病相关蛋白和药物研发中的价值，研究思路值得借鉴和学习。

参考文献：

• 1. Becker L A, Huang B, Bieri G, et al. Therapeutic reduction of ataxin-2 extends lifespan and reduces pathology in TDP-43 mice[J]. Nature, 2017, 544(7650): 367-371.
• 2. Kim G, Nakayama L, Blum J A, et al. Genome-wide CRISPR screen reveals v-ATPase as a drug target to lower levels of ALS protein ataxin-2[J]. Cell reports, 2022, 41(4): 111508.
• 3. Ghahremani Nezhad H, Franklin J P, Alix J J P, et al. Simultaneous ALS and SCA2 associated with an intermediate-length ATXN2 CAG-repeat expansion[J]. Amyotrophic Lateral Sclerosis and Frontotemporal Degeneration, 2021, 22(7-8): 579-582.