小布解读 | Nat Methods | 王友军/章晓辉/唐爱辉团队合作开发新型钙指示剂 NEMO-具有大动力学和高灵敏度

基因编码的钙指示剂（GECIs）是实时监测生物体中细胞内钙信号和细胞活动的不可或缺的工具。现有的GECIs面临着峰值信号-基线比（SBR）不佳，检测细微钙瞬态的分辨率有限的挑战。SBR（ΔF/F0），定义为绝对荧光(F)变化（F-F0，或ΔF）与基础荧光（F0）的比值，是用于衡量单色GECIs性能的关键参数。人们一直致力于生成具有更快动力学的GECIs（例如，jGCaMP8系列），但自大约10年前GECO和GCaMP6系列的开发以来，朝着增加最大荧光变化而取得的进展仍然相对滞后。

北京师范大学认知神经科学与学习国家重点实验室的章晓辉团队、生命科学学院的王友军团队与中国科学技术大学的唐爱辉团队，于2023年4月20日，Nature Methods 期刊在线发表了题为“Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity”的研究论文，该研究开发构建了一类检测钙信号的新型荧光蛋白探针NEMOs，具有更强的荧光信号和更精准的定量测定性能。鉴于NEMO钙指示剂对细胞内Ca2+信号的高灵敏度和分辨率，它可能被广泛应用于哺乳动物和植物，来监测神经元活动和其他Ca2+调节的生理过程。

基于mNeonGreen (mNG)设计的钙指示剂

采用亮度更高的新型荧光蛋白mNeoGreen（mNG）来替换广泛使用的cpGFP，结合多种设计及优化策略组合，构建了含几十个候选复合分子的GECI库，并通过系统的钙离子成像筛选和体外鉴定，最终获得了一组名为NEMO的新型GECI探针。研究人员首先评估了它们的基础荧光（F0）以及最大（Fmax）和最小（Fmin）荧光之间的比值，或DR（dynamic range），筛选出5种性能最好的结构，并将其命名为NEMO，包括中度（NEMOm）、高对比度（NEMOc）、快速（NEMOf）、明亮（NEMOb）和敏感（NEMOs）。

NEMO钙指示剂的体外表征
与目前为止最好的GECI相比较，NEMO钙指示剂的细胞DR总体较高。NEMOs和NEMOb的DR至少比GCaMP6m或NCaMP7高4.5倍，NEMOm和NEMOc至少高出9.5到25.7倍。NEMO钙指示剂基础荧光比NCaMP7低很多，NEMOc和NEMOf荧光亮度甚至只有GCaMP6m的0.25-0.5。尽管NEMOm，NEMOs和NEMOb的基础荧光亮度与GCaMP6m差不多，但是它们的DR比GCaMP6m高出5倍以上，所以它们的最大荧光亮度会比GCaMP6m亮。 为了研究是否有可能用更强的照明来补偿较弱的基础NEMO荧光，研究人员检测了NEMO钙指示剂的光稳定性，结果显示更强的光照（从0.04 mW到1.52 mW）可能会使NEMOm钙指示剂的基础荧光增强60倍以上，拓宽了NEMO传感器在需要更强光照的场景下的适用性，如用较暗的NEMOf钙指示剂监测亚细胞结构内的Ca2+信号。 NEMO钙指示剂在非兴奋细胞中的特性

在HEK293细胞中用CCh诱导的Ca2+瞬变，检测到NEMOb和NEMOs的峰信号-基线比（SBR，ΔF/F0）值至少是GCaMP6m、jGCaMP8f和NCaMP7的3倍。NEMOm、NEMOc和NEMOf的SBR值分别是GCaMP6m的13-25倍。同样，NEMO在检测的Ca2+振荡方面的性能也优于jGCaMP8f和NCaMP7。NEMO在检测HEK293细胞中弱Ca2+信号的时候，响应明显强于NCaMP7和GCaMP6。

 

通过比较NEMO和其他具有类似Ca2+亲和力GECIs的性能，研究了具有更大DR值的NEMO是否能够对不同振幅的Ca2+信号进行更敏感的识别。首先在不同的光激活时间下，GECIs对共表达光遗传工具, Opto-CRAC诱导的Ca2+内流逐步增加的反应，结果显示与GCaMP6m信号相比，NEMOm信号显著增大，并对长时间光刺激的反应逐步增加。接下来又比较了细胞外Ca2+浓度增加时的SOCE信号，结果显示NEMOm或NEMOs比GCaMP6m或NCaMP7能区分更多的外部Ca2+梯度，且信噪比高。另外还可以利用NEMOs进行间歇定量测量方法（iPEAQ）来测定Ca2+的浓度。

NEMO钙指示剂在神经元和植物中的特性
大鼠神经元离体电生理实验结果显示，所有的NEMO钙指示剂都能够检测到由单个动作电位（AP）引起的Ca2+信号，其峰值SBR大约是GCaMP6s或GCaMP6f的两倍。NEMOf响应很快，能区分频率高达5 Hz刺激的神经元反应。在5 Hz的场刺激下，NEMOf响应的峰值振幅约为GCaMP6f的3倍，使NEMOf成为最敏感和快速的GECIs之一。NEMO响应也是呈线性发展的，甚至在刺激达到180Hz时也没有明显的饱和。全细胞膜片钳实验说明用50 Hz或更高频率诱导AP后，所有NEMO的响应均显著高于GCaMP6，其中NEMOf表现出最快的动力学。

研究人员还证明NEMO钙指示剂可以用于植物，在检测拟南芥叶片中亚细胞Ca2+信号时，超分辨率成像结果显示，NEMOm融合到胞间连丝定位蛋白1上，可以很容易地检测到胞间连丝附近的Ca2+振荡，而胞间连丝是一种直径约为30-60纳米的植物细胞之间的结构。

NEMO钙指示剂在啮齿类动物大脑中的特性
 

用双光子激光显微镜测试了NEMO钙指示剂的体内性能，NEMOf是所有NEMO变体中速度最快的，其半衰变时间（409 ± 54 ms）与GCaMP6f（482 ± 48 ms）相当。NEMOm和NEMOs的峰值ΔF/F0的累积分布相对于GCaMP6信号明显向右移，表明NEMOm和NEMOs的反应更灵敏。此外，与GCaMP6相比，NEMOs在小鼠V1中表现出明显更好的信噪比和良好的基础荧光，NEMOf信号信噪比与GCaMP6f相似。

 

光纤记录实验记录NEMOs的响应，用410 nm光（F410）或470 nm光（F470）激发的GECI荧光的比率来表示由尾夹刺激引起的纹状体内神经元的Ca2+反应。尽管近紫外光（410 nm）激发降低了NEMOs的DR，且470 nm光也不是NEMOs最佳激发光波长，但是NEMOs的中位峰值响应约是GCaMP6f的3倍。

总结
NEMO钙指示剂具有快速的动力学和广泛的动态范围（>100倍）。NEMO钙指示剂报告Ca2+瞬态，峰值SBR比GCaMP6系列大20倍。NEMO钙指示剂比最流行的GCaMP系列更通用，它允许与青色荧光同时成像，具有更高的光稳定性，可以承受更强的光照，并更好地抵抗pH波动。总的来说，NEMO钙指示剂可以作为监测哺乳动物细胞、组织或体内以及植物中Ca2+动态的首选工具。