小布解读 | GRASP—标记活体神经系统突触连接
发布时间：2024-03-11 17:40:41
GRASP（green fluorescent protein reconstitution across synaptic partners，跨突触伴侣的绿色荧光蛋白重建）利用绿色荧光蛋白GFP检测神经元之间的距离以及是否形成突触连接，是由斯坦福大学的华人科学家沈康（Kang shen）和美国洛克菲勒大学的Cornelia I. Bargmann联合开发的，该技术可实现对活体神经系统中的突触定位。简单来说，就是将GFP分割为两个组件，分离的GFP组件不具有发光功能。在两组神经元中分别表达GFP的两个组件，当两组神经元存在突触连接时，GFP的两个组件在突触部位自动结合形成完整的具有功能的GFP，此时突触结构产生绿色荧光。如果两组神经元不存在突触连接，则不产生荧光。
示例1：小鼠脑内mGRASP的检测
2011年，美国霍华德-休斯医学研究所、韩国科学技术院及浙江大学等机构的研究人员在Nature Methods上发表题为“mGRASP enables mapping mammalian synaptic connectivity with light microscopy”的研究论文，对携带GFP组件的载体进行了改造，开发出了哺乳动物GRASP(mGRASP)技术，可以实现小鼠大脑中神经元突触的定位，实现了光学显微镜下快速准确重建哺乳动物大脑神经网络。通过mGRASP可以观察这些疾病下神经网络发生了怎样的变化，从而推断其病理机制。
在小鼠左脑半球CA3神经元中表达非Cre依赖的pre-mGRASP（rAAV CAG-pre-mGRASP-mCerulean），在右脑半球中表达Cre重组酶依赖post-mGRASP（rAAV CAG-Jx-rev-post-mGRASP-2A-dTomato）。分裂- GFP片段在单独表达时都不发出荧光，但mGRASP是跨突触重组的，在mCerulean标记的CA3轴突和dTomato标记的CA1树突相交的位置，沿着dTomato标记的CA1顶端和基部树突显示离散的荧光点（图1B，C）。
图1：海马CA3-CA1连通的mGRASP重构。
- 单个CA1神经元中重组mGRASP荧光的离散点。（B,C）裁剪高放大图像，其中蓝色轴突与红色树突相交（箭头）重构的mGRASP信号。比例尺，5µm（B）和1µm（C）。
示例2：mGRASP变体的选择和实验策略
2014年，美国霍华德-休斯医学研究所、韩国科学技术院及浙江大学等机构的研究人员在Nature Protocols上发表题为“Using mammalian GFP reconstitution across synaptic partners (mGRASP) to map synaptic connectivity in the mouse brain”的研究论文，作者介绍了几种具有Cre依赖性和荧光颜色选择的mGRASP变体，以便在实验策略中进行选择。这些mGRASP病毒构建体与大量Cre系相结合，可以选择和诱导突触标记，从而可以研究许多类型神经回路中的突触连接模式，如细胞类型特异性的局部和远程连接（图2）。
图2：mGRASP变体的原理图和mGRASP辅助电路映射的实验设计
- mGRASP变体示意图。（B，C）通过将mGRASP AAV变体注射到野生型（非特异性）或细胞类型特异性Cre小鼠系感兴趣的大脑区域，可以绘制出各种远程（B）和局部回路（C）。
示例3：Dual-eGRASP区分单个神经元上的两个突触群
2018年首尔国立大学生物科学学院研究人员在Science上发表题为“Interregional synaptic maps among engram cells underlie memory formation”的研究论文，为了比较神经元中两个不同的突触前群体投射到单个突触后神经元，作者对GRASP技术进行了改进，开发了一种增强的GRASP（eGRASP）技术，该技术通过引入一个弱相互作用域来促进GFP重构，增强GRASP信号强度，并进一步进化eGRASP以重建青色或黄色荧光蛋白（图3A,B）。将颜色决定域置于突触前神经元（青色/黄色pre-eGRASP），将共同域置于突触后神经元（post-eGRASP），可以可视化两个突触群，这两个突触群来自两个不同的突触前神经元群，并投射到单个突触后神经元，作者将这种技术命名为dual-eGRASP（图3A）。作者成功地将这项技术应用于齿状回（DG）颗粒细胞上的突触，这些细胞分别来自外侧内嗅皮层（LEC）或内侧内嗅皮层（MEC），它们分别投射到DG的外层和中间分子层（图3D）。
图3：Dual-eGRASP区分单个神经元上的两个突触群。
（A,B）青色和黄色eGRASP示意图。青色pre-eGRASP和黄色pre-eGRASP在两个不同的突触前细胞中表达，而普通的post-eGRASP在单个突触后细胞中表达。（D)）LEC和MEC分别表达青色和黄色的pre-eGRASP，DG中post-eGRASP与肉豆蔻酰基化TagRFP-T （myr_TagRFP-T）一起表达。
示例4：利用mGRASP标记PTSD小鼠MD投射到ACC的局部微环路
利用mGRASP测试PTSD小鼠中增强的MD突触输入是否重塑了ACC的局部突触连接。该技术基于在突触前和突触后神经元中表达两个功能互补的非荧光GFP片段（AAV2/8-CAG-pre-GRASP-mCerulean AAV2/8-CAG-DIO-post-GRASP-P2A-tdTomato, Braincase (shenzhen)），专门标记MD和ACC两个神经元群体之间的突触，以获得更准确和特异性的可视化（图4M）。实验结果显示，WT小鼠ACC区PV+神经元的丘脑皮质突触频率明显高于锥体神经元（也就是CaMKII+神经元），这意味着MD和ACC PV+神经元之间可能存在更强的联系（图4N,O）。与WT小鼠相比，PTSD小鼠中的PV+中间神经元的丘脑皮质突触数量增加（图4Q,S）。而锥体神经元的突触在两组小鼠之间没有显著性差异（图4P,R）。说明在PTSD小鼠的恐惧消退过程中，MD优先投射到ACC的PV+神经元。
图4：在PTSD小鼠的恐惧消退过程中，MD优先投射到ACC中的PV+神经元
（M）使用PV-Cre、SST-Cre或CaMKII-Cre病毒标记突触的机制示意图。（N,O）WT小鼠丘脑皮质CaMKII+与PV+神经元突触频率高倍共聚焦图像（N）和量化图（O）。（P,Q）ACC中mGRASP标记的CaMKII+神经元（P）/ PV+神经元（Q）与突触（绿色）的高倍共聚焦（上）和3D图像（中、下）。（R,S）WT小鼠与PTSD小鼠丘脑皮质CaMKII+神经元（R）/ PV+神经元（S）突触频率量化图。
研究人员通过进一步对载体进行改造，开发出来的哺乳动物GRASP（mGRASP）和强化版双GRASP技术（dual-eGRASP）技术，不仅可以实现了小鼠大脑中神经元突触的定位，结合化学技术与计算机生物图像信息学技术，实现高通量的神经网络重建，而且可以用于神经系统疾病的研究，比如抑郁症、帕金森、癫痫等神经疾病可能存在神经元的异常连接，通过GRASP可以观察这些疾病下神经网络的变化，从而推断病理机制。
布林凯斯可提供及定制GRASP相关产品，现货产品如下：
| 产品类型 |
产品编号 |
产品名称 |
| 荧光标记 |
BC-1424 |
rAAV-EWB-DIO-myriRFP670V5-P2A-post-eGRASP |
| BC-1425 |
rAAV-CWB-pre-eGRASP(p30) |
| BC-1626 |
rAAV-CAG-pre-mGRASP-mCerulean |
| BC-1627 |
rAAV-CAG-DIO-post-mGRASP-T2A-dTomato-WPREs |
| BC-2371 |
rAAV-CAG-DIO-pre-mGRASP-miRFP670nano3-WPRE-hGH polyA |
| BC-2372 |
rAAV-CAG-post-mGRASP-T2A-dTomato-WPREs |
参考文献
- Feinberg EH, Vanhoven MK, Bendesky A, et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron. 2008;57(3):353-363.
- Kim J, Zhao T, Petralia RS, et al. mGRASP enables mapping mammalian synaptic connectivity with light microscopy. Nat Methods. 2011;9(1):96-102.
- Feng L, Kwon O, Lee B, Oh WC, Kim J. Using mammalian GFP reconstitution across synaptic partners (mGRASP) to map synaptic connectivity in the mouse brain. Nat Protoc. 2014;9(10):2425-2437.
- Choi JH, Sim SE, Kim JI, et al. Interregional synaptic maps among engram cells underlie memory formation. Science. 2018;360(6387):430-435.
- Xiao H, Xi K, Wang K, et al. Restoring the Function of Thalamocortical Circuit Through Correcting Thalamic Kv3.2 Channelopathy Normalizes Fear Extinction Impairments in a PTSD Mouse Model. Adv Sci (Weinh). Published online December 16, 2023.
