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• Q1: 影响RNA干扰效率的因素有哪些？

  A：

  ①结构的不同（双链RNA比单链具有更高效力），Similar behaviour of single-strand and double-strand siRNAs suggests they act through a common RNAi pathway（https://academic.oup.com/nar/article/31/9/2401/1080348）（http://europepmc.org/article/PMC/154224）；

  ②序列的不同，

  ③处于mRNA位置的不同，https://www.biomart.cn/experiment/430/443/450/680/2282559.htm

• Q2: 设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？

  A：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：

  1）外源插入片段的拷贝数，多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰；

  2）整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还更容易得到混合稳定株；

  3）整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量；

  4）整合后的稳定性。不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况；

  5）使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助获得更精确的实验数据。（https://wenku.baidu.com/view/306486dc6f1aff00bed51e78.html）

• Q3: 影响siRNA转染效率的因素有哪些？

  A：（https://zhuanlan.zhihu.com/p/100352316）

• Q4: 如何解决脂质体转染试剂毒性大的问题？

  A：https://zhuanlan.zhihu.com/p/29140323

• Q5: 病毒感染细胞实验中，使用感染增强剂出现细胞毒性的原因是什么？

  A：

  ①增强剂用量过大，可适当减少其用量；

  ②病毒量过大，可适当减少病毒用量，可采用更换培养基或增加培养基量的方法。（https://zhuanlan.zhihu.com/p/126995361）

• Q6: 用于病毒感染的细胞接种量多少为宜？
  A：根据细胞增殖速度决定接种量，一般需保证感染后4天左右细胞刚好快长满培养皿底部。对于大部分细胞系：传代周期2-3天，感染时细胞铺板密度保持在20%-30%范围内。对于某些原代细胞：细胞生长缓慢，接种时汇合度可提升至50%-60%，保证感染后4天左右细胞汇合度达到90%-100%。对于非分裂细胞：接种后不再增殖（如神经元细胞），按照汇合度100%进行接种。
• Q7: 加入病毒后，细胞死亡严重，是什么原因？该如何处理？
  A：一般是病毒对细胞具有一定毒性，可调整、降低感染MOI值。并密切关注细胞状态，在感染后4、8、12小时定时观察细胞情况。若出现细胞状态变差情况，立即对细胞进行换液处理，使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。
• Q8: 如何提高病毒感染效率？
  A：病毒感染效率受多个因素影响，包括细胞自身生长状态、细胞数量、细胞被感染的难易程度等。因此在实验过程中，保证细胞正常增殖、轮廓清晰，同时保持合适的细胞密度，选择最佳感染条件可更好保证感染效率。对于悬浮细胞，可采用离心感染的方法，减少病毒感染时的体积，从而提高感染效率。如培养板密封，可用平角转子离心机1000 g离心1hrs，再放回培养箱中继续正常培养。
• Q9: 细胞能被病毒感染，但为什么GFP荧光很弱？
  A：GFP病毒感染细胞后，细胞荧光强度取决于病毒进入细胞颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP基因启动子活性等因素。因此，目的细胞感染病毒颗粒数越多、细胞增殖越快，GFP荧光会较强。一般，病毒在增殖较快的细胞中感染96-120 hrs后，GFP蛋白表达才达到峰值；在增殖较慢的细胞中，这一时间更长。强启动子后的GFP基因荧光表达强，反之，弱启动子后面的荧光表达较弱。
• Q10: 细胞转染实验影响因素有哪些？

  A：https://zhuanlan.zhihu.com/p/29100441

• Q11: 条件性基因敲除的时间特异性是怎么实现的？

  A：https://www.sohu.com/a/200476821_100007412