1）RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。
2）细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细胞数量较少时转染效率高。由于siRNA沉默时效性的影响，转染后48小时才能进行进行qRT-PCR检测，转染后48-72小时才能进行蛋白检测。如果转染时铺板密度较高，细胞一方面转染效果不理想，直接影响沉默效果和数据可靠性，另一方面，48小时甚至更长时间后，沉默检测最佳点时，过于密集的细胞将影响细胞状态，从而影响实验结果。
3）RNA效率不高 实验时选择最优RNA，并采用已知高效的RNA做对照。siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA，siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。
4）转染试剂不合适 可更换转染试剂，或选择专门针对siRNA转染的试剂，如Entranster试剂。
1）外源插入片段的拷贝数 多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰；
2）外源基因整合的几率 这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还更容易得到混合稳定株；
3）整合位点的转录活跃度 决定了稳定株中外源片段的表达质量；
4）整合后的稳定性 不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况；
5）使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株 因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助获得更精确的实验数据。
1）纯化RNA 在转染前要确认RNA的大小和纯度。为得到高纯度的RNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。
2）避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致RNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。
3）健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 通常，健康的细胞转染效率较高。此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。为了优化实验，推荐用50代以下的转染细胞，否则细胞转染效率会随时间明显下降。
1)双酶切时使用错误的酶；
2)双酶切选择两个酶切位点距离过近；
3)酶切产生的粘性末端可以互补；
4)使用了对甲基化敏感的限制性内切酶，如Dpnll；
5)宿主菌选择不恰当，如在Gateway克隆中使用含F质粒的菌株；
6)使用高拷贝数的骨架来克隆大片段，如质粒相对拷贝数高但装载量最高为30 kb，AAV最小为4.7 kb同时相对拷贝数较高，慢病毒相对拷贝数第但装载可稳定在9,2 kb。
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