细胞实验

• Q1: 细胞转染实验影响因素有哪些？

  A：

  1）转染试剂 不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。

  2）细胞生长状态 一般低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。也就是说同一种系的细胞株，在各实验室不同培养条件下，其生物学性状发生不同程度的改变，导致其转染特性也发生变化。因此，如果发现转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。

  3）转染方法 因不同实验室培养的细胞性质不同，质粒定量差异，操作手法上的差异等，其转染效果可能不同，应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。

  4）载体结构 转染载体的构建（病毒载体，质粒DNA，RNA，PCR产物，寡核苷酸等）也影响转染结果。病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高，但不同病毒载体有其特定的宿主，有的还要求特定的细胞周期，如逆转录病毒需侵染分裂期的宿主细胞，此外还需考虑一些安全问题（如基因污染）。除载体构建外，载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响，如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响。如果基因产物对细胞有毒性作用，转染也很难进行，因此选择组成或可调控，强度合适的启动子也很重要，同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰。

• Q2: 病毒感染细胞实验中，使用感染增强剂出现细胞毒性的原因是什么？

  A：

  1）增强剂用量过大，可适当减少其用量；

  2）病毒量过大，可适当减少病毒用量，可采用更换培养基或增加培养基量的方法。

• Q3: 用于病毒感染的细胞接种量多少为宜？

  A：

  1）根据细胞增殖速度决定接种量，一般需保证感染后4天左右细胞刚好快长满培养皿底部。

  2）对于大部分细胞系：传代周期2-3天，感染时细胞铺板密度保持在20%-30%范围内。

  3）对于某些原代细胞：细胞生长缓慢，接种时汇合度可提升至50%-60%，保证感染后4天左右细胞汇合度达到90%-100%。

  4）对于非分裂细胞：接种后不再增殖（如神经元细胞），按照汇合度100%进行接种。

• Q4: 加入病毒后，细胞死亡严重，是什么原因？该如何处理？
  A：一般是病毒对细胞具有一定毒性，可调整、降低感染MOI值。并密切关注细胞状态，在感染后4、8、12小时定时观察细胞情况。若出现细胞状态变差情况，立即对细胞进行换液处理，使用新鲜的完全培养液替换病毒感染培养液。
• Q5: 如何提高病毒感染效率？
  A：病毒感染效率受多个因素影响，包括细胞自身生长状态、细胞数量、细胞被感染的难易程度等。因此在实验过程中，保证细胞正常增殖、轮廓清晰，同时保持合适的细胞密度，选择最佳感染条件可更好保证感染效率。对于悬浮细胞，可采用离心感染的方法，减少病毒感染时的体积，从而提高感染效率。如培养板密封，可用平角转子离心机1000 g离心1 hrs，再放回培养箱中继续正常培养。
• Q6: 细胞能被病毒感染，但为什么GFP荧光很弱？
  A：GFP病毒感染细胞后，细胞荧光强度取决于病毒进入细胞颗粒数、细胞本身的增殖状态、细胞类型、观察时间、GFP基因启动子活性等因素。因此，目的细胞感染病毒颗粒数越多、细胞增殖越快，GFP荧光会较强。其次，病毒在增殖较快的细胞中感染96-120 hrs后，GFP蛋白表达才达到峰值；在增殖较慢的细胞中，这一时间更长。此外，强启动子后的GFP基因荧光表达强，反之，弱启动子后面的荧光表达较弱。
• Q7: 电穿孔转染效果不佳，其影响因素可能有哪些？

  A：电转是高效、简便的基因转移系统，具有其他转移方法无法比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，转染率高，适用广谱等，尤其对目前一般认为难转的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。若电转效果不佳，可考虑一下条件进行优化：

  1）电场参数 电场强度是应该被优化的主要参数。电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以采取较为简便的间接法。文献显示存活率在50%左右的电场参数为理想参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。

  2）脉冲过程
  ①脉冲波形主要分为两种，方波脉冲和指数递减波脉冲。一般哺乳动物细胞电转选择方波脉冲，细菌、酵母菌、昆虫细胞选择指数递减波脉冲。
  ②脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。在方波脉冲中，脉冲时间可直接设定。在指数递减波脉冲中，脉冲时间是指电压衰减至初始电压1/3时所用的时间，等于电容（C）与电阻（R）的乘积，单位是ms。在参数优化中，增加电压应当降低脉冲时间，而减小电压则应当增大脉冲时间。
  ③一般而言，对于大多数细胞类型都选择单次脉冲。而在有些情况下可能会用到多次脉冲，因为低电压、短脉冲时间、多次脉冲可有效避免细胞损伤。多次脉冲建议中间间隔1min。

  3）细胞因素 用于电转的细胞一般选取处于对数生长期的细胞（15代以内，传代后2d）。细胞悬液浓度一般为1*106/ml，当细胞生长密度大于3*106/ml，转染效率会下降。

  4）质粒因素 从质粒浓度看，细胞密度为1*106/ml，DNA用量在2-5 μg/ml转染效率最高。

  5）温度 一般情况下，电转的过程是在室温下进行，但在电击前后需对细胞进行冰浴处理。

  6）电转后培养液的选择 细胞在电击后十分脆弱，其培养液的选择应注重提高细胞的存活率，一般选择 低渗的RPMI 1640+10％FCS。除此之外，可参考加入50 mmol／L海藻糖+1.25％DMSO。

• Q8: siRNA导入细胞有哪些方法，哪种最好？
  A：siRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。对贴壁细胞来说化学转染技术是最为常用的方法，而对悬浮细胞则采用电穿孔法效果较好。
• Q9: 体内转染（Entranster-in vivo）效果如何检测？
  A：一般根据课题研究要求进行，如果单纯检测转染效率，推荐用qRT-PCR方法和luciferase方法。还可根据研究，采用组织学和生理学，以及物理测量的方法进行。由于体内转染的复杂性，通常体外试验中常采用的转染GFP蛋白用荧光显微镜观察的方法，由于体内取出的组织材料背景高，检测较为困难。
• Q10: 影响siRNA转染效率的因素有哪些？

  A：

  1）RNA与转染试剂比例不佳 由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。

  2）细胞密度不佳 调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细胞数量较少时转染效率高。由于siRNA沉默时效性的影响，转染后48小时才能进行进行qRT-PCR检测，转染后48-72小时才能进行蛋白检测。如果转染时铺板密度较高，细胞一方面转染效果不理想，直接影响沉默效果和数据可靠性，另一方面，48小时甚至更长时间后，沉默检测最佳点时，过于密集的细胞将影响细胞状态，从而影响实验结果。

  3）RNA效率不高 选择最优RNA，并采用已知高效的RNA做对照。siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA，siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。