客户文章｜超亮、超快、超好！基于RV-CVS病毒的皮层第六层细胞标记新方法

哺乳动物大脑皮层可分为6层，是大脑处理感觉信息的重要结构基础。与浅层相比，大脑皮层第六层（layer 6, L6）是发育过程中最早出现，但深入研究相对较少的一层结构。L6的细胞复杂多样，大多数物种的感觉皮层L6主要存在两类锥体神经元：投射到丘脑的corticothalamic（CT）神经元，皮层内投射的corticocortical（CC）神经元。虽然L6神经元的特异性标志物和投射特性已被部分揭示，但L6神经元是如何整合来自树突上不同时间与空间的输入进而产生输出仍不清楚，主要归结于L6神经元高质量功能成像的技术难题。

2023年4月21日，陆军军医大学张健雄团队联合重庆脑与智能科学中心（广阳湾实验室）、广西大学、苏州医工所、德国莱布尼兹研究所，共同在《iScience》杂志上在线发表题为“Rabies virus-based labeling of layer 6 corticothalamic neurons for two-photon imaging in vivo”的研究论文。该研究开发了一种基于RV-CVS病毒的标记方法，该方法标记后可直接使用传统双光子显微镜对小鼠听觉皮层L6中的投射特异性CT神经元进行结构和功能成像。这种标记方法具有超高亮度和一周内超快表达的优点，可用于深层神经元胞体和树突棘等亚细胞结构的高质量成像。

L6 CT神经元多尺度结构成像

RV-CVS标记的神经元具有足够高的荧光强度，可以对L6神经元进行高对比度的结构成像。研究者使用CVS-GFP特异性标记听觉皮层投射到MGB的L6神经元，与AAV标记的神经元相比，RV-CVS标记神经元的胞体、树突和树突棘在更深的层中具有更高的荧光水平。对不同层的多尺度结构的荧光强度定量测量表明，RV-CVS标记能分辨出L5的单个树突棘和L6的树突结构。因此，RV-CVS标记大大改善了L6 CT神经元的成像质量，使单个树突和树突棘能够在更深的层中进行研究。

L6 CT神经元群体功能Ca2+成像

双光子在体群体Ca2+成像的一个常见问题是神经元信号经常被相邻的神经纤维干扰。为了测试RV-CVS标记是否会受到这种干扰，研究者使用CVS-GCaMP6s特异性标记听觉皮层投射到MGB的L6神经元，并对神经元及其相邻的神经纤维的信号进行了随机采样。结果显示神经元被噪音刺激（BBN）诱发的反应幅度远远高于附近的神经纤维的幅度。接下来，研究者对清醒小鼠L6 CT群体神经元进行了功能Ca2+成像，计算每个神经元被BBN诱发的幅度，并根据它们从声音前到声音后的相对变化对所有897个神经元的活动水平进行排序。以上实验表明，CVS-GCaMP6s标记能够对L6的CT神经元进行高质量的Ca2+成像。

L6 CT神经元亚细胞结构功能Ca2+成像

除了群体成像，RV-CVS标记可以在亚细胞分辨率下对跨越整个皮层的L6单细胞结构进行高质量的Ca2+成像。研究者对同一神经元不同部位的Ca2+信号从浅层到深层进行记录，发现与浅层相比，位于L4和L5的神经元树干的Ca2+信号幅度和频率大大增加。研究者对同一个神经元从浅到深共记录了20个焦平面，并在时间和空间维度上完全重建其功能图谱，以显示所有结构的反应特征。这些都表明，通过在单细胞分辨率下对L6 CT神经元的树突和胞体进行成像，RV-CVS标记提供了一个合适的方法来研究树突信息整合。

综上所述，研究者开发了一种基于RV-CVS的神经元标记策略，能够对小鼠听皮层 L6 CT神经元进行高对比度、多尺度、高质量结构和功能成像。

广西大学博士生古妙清为本论文的第一作者。该工作得到了国家自然科学基金和中国科学院科学仪器研制项目的大力支持。

原文链接：https://www.cell.com/iscience/fulltext/S2589-0042(23)00702-2#%20

原文中相关产品布林凯斯都可以提供，还有RV-CVS系列产品：