客户文章︱Nat. Commun.︱中科大张智团队揭示“疼痛抑制疼痛”的神经环路机制

在人类和动物中，一个部位的疼痛可以抑制其他部位的疼痛感知，这种现象在人类中称为条件性疼痛调制（CPM），在动物中称为弥散性伤害性抑制控制（DNIC）。尽管已有研究关注了脑干到脊髓的下行投射在DNIC中的作用，但关于大脑皮层如何调节“疼痛抑制疼痛”的机制仍不清楚。

2025年2月21日，中国科学技术大学张智/朱霞团队和安徽医科大学陶文娟团队合作在Nature Communications杂志发表了题为“Intra-somatosensory cortical circuits mediating pain-induced analgesia”的研究论文，揭示了S2到S1HL的前馈抑制环路，以及跨半球的对侧S2到S2再到S1HL的环路，分别介导同侧和对侧疼痛诱导的镇痛。

为了确定疼痛是否能抑制小鼠其他部位的疼痛，首先通过向左后足注射完全弗氏佐剂（CFA，1mg/ml，10μl），建立了炎症性疼痛模型。通过捏、注射辣椒素等方式施加伤害性刺激，结果发现，刺激小鼠的左前爪、右前爪或脸颊，都能显著抑制其左后爪的疼痛相关行为，提高疼痛阈值。具体而言，在von Frey测试中检测到疼痛阈值升高（即机械敏感性阈值增加），在热板测试中检测到舔舐反应的潜伏期延长，在刷子测试中动态评分降低，以及在自发疼痛测试中自发疼痛评分减少，并且在移除夹持刺激后20分钟这种效应逐渐减弱（图1a-b）。而且，这种镇痛效果在刺激去除后一段时间内会逐渐消失，并且与刺激强度有关，例如低浓度辣椒素（1μg/10μl）无法有效提高疼痛阈值，而5μg/10μl和10μg/10μl的辣椒素则效果显著（图1c-h）。此外，研究还排除了注意力分散对实验结果的干扰，证明“疼痛抑制疼痛”是真实的神经调控现象。

为了验证是否存在一个神经元集合可能存在于躯体感觉皮层，负责不同部位的疼痛，并介导疼痛诱导的镇痛。研究人员将表达他莫昔芬诱导型Cre重组酶的小鼠FosCreERT2 (Fos-TRAP2)与Ai14-tdTomato小鼠杂交，获得报告小鼠品系FosTRAP2:Ai14。在小鼠腹腔注射4-羟基他莫昔芬（4-OHT）后，向其左前爪、右前爪或脸颊注射辣椒素，2周后处死小鼠，检查全脑切片中tdTomato的表达，以此指示神经元的活动。在注射辣椒素的CFA小鼠中，与对照组相比，左前爪注射辣椒素后，右侧次级躯体感觉皮层（S2）、右侧初级躯体感觉皮层前爪区域（S1FL）和左侧对侧S2（contra-S2）的tdTomato表达显著增加，而右侧初级躯体感觉皮层的后爪区域（S1HL）的tdTomato表达显著降低（图2a-c）；右前爪注射辣椒素的CFA小鼠，在对侧S1FL、S2和对侧S2中tdTomato表达显著增加，S1HL中显著减少；脸颊注射辣椒素的CFA小鼠，在岛叶皮层（IC）、初级躯体感觉皮层桶状区域（S1BF）、S2和对侧S2中tdTomato表达显著增加，S1HL中显著减少。这些结果表明，S2中表达c-Fos（被TRAP标记）的神经元在三个测试部位给予疼痛刺激时均增加，且激活的S2神经元主要集中在2-4层（图2d-g），而S1HL中表达cfos的神经元显著减少，表明躯体感觉皮层（S2和S1）参与了疼痛诱导的镇痛。

为了研究同一组神经元在不同部位的镇痛过程中是否被激活，研究人员使用FosTRAP2:Ai14 CFA小鼠，捕获右前爪或脸颊注射辣椒素时激活的S2神经元，并对这些小鼠进行c-Fos免疫组织化学染色，以标记左前爪注射辣椒素时激活的S2神经元。结果发现，CFA小鼠左前爪和右前爪注射辣椒素激活的S2神经元重叠率约为70%，左前爪和脸颊注射辣椒素激活的S2神经元重叠率约为72%。同时，通过盐水注射实验排除了S2神经元激活是由基础活动增加导致的可能性。综上所述，不同部位的有害刺激物在S2中激活了同一群神经元（图3h-l）。

为了研究S2和S1HL神经元在疼痛诱导镇痛中的潜在作用，研究人员利用微内镜成像技术，通过监测钙反应来同时分析S2和S1HL谷氨酸能神经元（S1HL-glu）的活动模式。向FosTRAP2小鼠的S2注射表达Cre依赖的钙成像指示剂GCaMP6m的腺相关病毒（AAV-DIO-GCaMP6m），S1HL注射AAV-CaMKII-GCaMP6m，并在相应位置安装微内镜梯度折射率（GRIN）透镜（图4a）。向小鼠左前爪注射辣椒素或生理盐水，结果显示，注射辣椒素的CFA小鼠，其被TRAP标记的S2神经元的Ca²⁺瞬变频率和平均z评分活动显著增加（图4b-c）；而S1HL-glu神经元的Ca²⁺瞬变频率和平均z评分活动显著降低（图4d-e）。

研究人员利用化学遗传学方法，向FosTRAP2小鼠S2注入Cre依赖的hM4Di-mCherry病毒（AAV-DIO-hM4Di-mCherry）抑制被TRAP标记的S2神经元，同时向S1HL注入AAV-CaMKII-GCaMP6m病毒监测S1HL-glu神经元活动（图5f）。结果显示，抑制S2神经元消除了注射辣椒素引起的S1HL-glu神经元Ca²⁺瞬变频率和平均z评分活动的降低（图5g-h），同时阻断了疼痛诱导的后爪镇痛；相反，化学遗传学激活S2神经元会显著增加CFA小鼠的疼痛阈值（图5i-j）。这些结果表明，S2通过抑制S1HL-glu神经元的活动来介导不同部位疼痛诱导的镇痛。

利用细胞类型特异性顺向跨单突触示踪系统，向FosTRAP2小鼠的S2注射携带Cre依赖的TK-GFP病毒（AAV-DIO-TK-EGFP），三周后再注射HSV-ΔTK-tdTomato病毒（图6a）。结果显示，在初级运动皮层、初级躯体感觉皮层的多个区域、对侧S2等部位检测到tdTomato⁺信号，且这些信号主要分布在S1HL的第4层，与谷氨酸特异性抗体共定位约30%，与GABA特异性抗体共定位约65%（图6b-c），表明TRAPed S2神经元主要支配S1HL第4层的GABA能神经元。采用细胞类型特异性逆向跨单突触示踪策略，向CaMKII-Cre小鼠的S1HL注射Cre依赖的辅助病毒，三周后注射狂犬病病毒RV-EnvA（图6d）。在S2中鉴定出大量与谷氨酸能神经元共染的DsRed标记神经元，在GABA合成酶谷氨酸脱羧酶2（GAD2）-Cre小鼠中也有类似发现（图6e-g），说明S1HL-glu和S1HL-gaba神经元均接受来自S2的直接支配。

向FosTRAP2小鼠的S2注入AAV-DIO-ChR2-mCherry病毒，向S1HL注入AAV-CaMKII-GFP病毒（图7h-i），记录S1HL神经元的光诱发突触后电流。在-70mV的保持电位下，光刺激S2纤维可诱发S1HL-glu神经元产生可靠的兴奋性突触后电流（EPSCs），可被离子谷氨酸AMPA受体拮抗剂（DNQX）阻断；在0mV的保持电位下，光刺激还可诱发抑制性突触后电流（IPSCs），它也能被DNQX阻断，且IPSCs潜伏期长于EPSCs（图7j-k），表明S1HL-glu神经元受局部S1HL-gaba中间神经元支配，二者均接受S2直接输入。此外，在GAD2-Cre小鼠的S1HL注入相关病毒后（图7l-m），蓝光刺激局部S1HL-gaba神经元可使S1HL-glu神经元的IPSCs显著增加，且可被GABA受体拮抗剂（bicuculline）阻断（图7n-o），进一步证实了S2→S1HL-gaba→S1HL-glu前馈抑制环路的存在。向FosTRAP2小鼠的S2注入AAV-DIO-hM4Di-mCherry病毒，并在S1HL植入套管，进行化学遗传学抑制实验（图7p）。结果表明，化学遗传学沉默S2-S1环路后，后爪疼痛阈值的增加被消除，且沉默该环路不影响小鼠的运动功能（图7q），说明左前爪的伤害性刺激激活S2→S1HL-gaba→S1HL-glu前馈抑制环路，在不损害运动功能的情况下介导疼痛诱导的镇痛。

以往研究表明，在哺乳动物大脑中，躯体感觉处理具有侧化特征，即身体一侧的感觉信息主要在对侧大脑半球进行处理。已知右前爪（对侧身体部位）的伤害性刺激能抑制左后爪的疼痛相关行为，且右半侧身体的伤害性信息由对侧大脑半球编码。基于此，研究人员推测对侧S2对于S2→S1HL环路的支配，可能在CFA小鼠中，介导右前爪伤害性刺激诱导的左后爪镇痛。为验证该假设，研究人员采用了三级逆行追踪策略。首先，向C57小鼠的S1HL注射retro-AAV-hSyn-Cre病毒；同时向S2注射Cre依赖的辅助病毒；3周后，再向S2注射RV-ΔG-DsRed病毒（图8a）。在注射后进行检测，研究人员在皮层、丘脑等脑区以及对侧S2（且与谷氨酸抗体共定位）中检测到了DsRed⁺信号（图8b-d）。这一结果表明，S2→S1HL环路确实接收来自对侧S2的直接神经支配。通过向C57小鼠的对侧S2注射AAV-hSyn-Cre病毒，向S2注射AAV-DIO-YPet病毒，利用CLARITY技术使大脑半透明，实现全脑成像（图8e-f），观察S2神经元的投射。结果显示，S2与对侧S2有显著连接，同时向同侧S1和初级运动皮层（M1）投射（图8g-h），还存在大量皮质下投射，表明S2神经元与对侧S2相互作用，并支配S1HL。

接下来检测了对侧疼痛诱导镇痛过程中对侧S2、S2和S1HL-glu的神经元活性，向FosTRAP2小鼠的对侧S2、S2和S1HL分别注入AAV-DIO-GCaMP6m和AAV-CaMKII-GCaMP6m病毒（图9i），通过微内镜成像监测钙反应。在向小鼠右前爪注射辣椒素后，发现对侧S2和S2神经元的瞬变频率和平均z评分活动均显著增加，而S1HL-glu神经元的这两个指标显著降低（图9j-o）。

进一步利用化学遗传学病毒抑制对侧S2神经元，并通过注射AAV-DIO-GCaMP6m和AAV-CaMKII-GCaMP6m病毒来监测S2和S1HL-glu神经元的活性（图10a），结果显示，抑制对侧S2神经元后，由右前爪注射辣椒素引起的CFA FosTRAP2小鼠的S2神经元活动增加和S1HL-glu神经元活动减少均被阻断（图10b-e），表明在对侧疼痛诱导镇痛过程中，对侧S2→S2→S1HL通路被激活。为探究对侧S2→S2→S1HL通路对对侧疼痛诱导镇痛是否必要，研究人员向FosTRAP2小鼠的对侧S2注入AAV-DIO-hM4Di-mCherry或AAV-DIO-mCherry病毒，并在S2植入套管，进行化学遗传学抑制实验。结果显示，抑制对侧S2神经元后，由右前爪注射辣椒素引起的S2神经元活动增加和S1HL-glu神经元活动减少均被阻断，同时后爪疼痛阈值的增加也被消除（图10f-g），证明了对侧S2→S2→S1HL环路在对侧疼痛诱导镇痛中被激活，且是对侧疼痛诱导镇痛所必需的。

这项研究首次明确了躯体感觉皮层内介导“疼痛抑制疼痛”的神经环路，拓展了人们对疼痛缓解机制的理解。从基础研究角度看，揭示了S2不同层神经元在疼痛调制中的功能异质性，以及S2与S1连接在协调身体不同部位疼痛感知中的重要性。从临床应用前景来说，为开发新型疼痛治疗方法提供了潜在靶点。未来，或许可以通过精准调控这些神经环路，更有效地缓解慢性疼痛患者的痛苦。