基因编码钙指示剂（Genetically encoded calcium indicators, GECIs）已成为活体监测神经元活动的关键工具。绿色荧光蛋白（GFP）家族的GECIs（如GCaMP系列）在多种模式生物中已经经过广泛优化，实现了对神经元活动的高效监测。然而，红色荧光钙指示剂的研发进度相对落后，现有变体数量少、性能较弱。
2025年2月2日，西湖大学 Kiryl Piatkevich 教授团队在 bioRxiv 上发表了题为“A Sensitive Soma-localized Red Fluorescent Calcium Indicator for Multi-Modality Imaging of Neuronal Populations In Vivo”的研究，基于拓扑反转（topological inversion）和细胞体靶向（soma-targeting）策略对红色荧光蛋白进行了重新设计，构建了一种新的红色基因编码钙指示剂 FRCaMP，并在此基础上开发出性能更优的 FRCaMPi 以及胞体定位版 SomaFRCaMPi。与目前常用的 jRGECO1a 相比，SomaFRCaMPi 拥有更广的动态范围、更高的峰值ΔF/F0和更佳的信噪比（SNR）。特别值得关注的是，SomaFRCaMPi 的整体表现已可与性能最优的绿色胞体定位GECI相媲美，并在提升神经元活动成像的准确性方面展现了潜在优势。
首先，通过对初代 FRCaMP 的拓扑结构进行“反转”处理，开发出了一种新的红色基因编码钙指示剂 FRCaMPi。通过把mApple从与初代的 FRCaMP 相比，FRCaMPi 的钙结合亲和力提高了约三倍，在神经元中初检测的峰值荧光是前体 FRCaMP 的 2.36 倍。在海拉细胞与培养的海马神经元实验中，FRCaMPi 相较于 jRGECO1a 拥有更高的灵敏度和更宽的动态范围（图1，图2）。同时，FRCaMPi 在体内光纤成像验证中展现了长达3个月的可靠稳定性与适用性。
图1 HeLa细胞中FRCaMPi的特性分析
图2 FRCaMPi的设计及其在原代小鼠海马神经元中的特性表征
为实现胞体定位并探索目前红色探针经胞体定位后的特性，作者在探针C端添加了由RPL10介导的核糖体定位肽，从而构建了红色靶向细胞体钙指示剂 SomaFRCaMPi。与其他胞体定位版的红色探针相比，SomaFRCaMPi 的灵敏度与动态范围均显著提升，且信噪比在动态范围内至少是其他红色探针的两倍以上。培养神经元实验还显示出 SomaFRCaMPi 具备较高的基线亮度、更低的毒性以及相较于非胞体版本更灵敏的表现。这些结果表明其成为体内神经元钙成像的有力工具，优于其他红色钙指示剂（图3，图4）
图3 SomaFRCaMPi改造及在原代小鼠海马神经元中电场刺激特性表征
图4红色GECIs在原代海马神经元中基线亮度和光漂特征
在体实验中，作者先通过转基因斑马鱼模型（全神经元表达）测试了 SomaFRCaMPi 的性能，并与非靶向的 jRGECO1a 和 FRCaMPi 进行了比较。结果表明，SomaFRCaMPi 的荧光信号局限于胞体区域，并在细胞分割方面表现出显著数量优势，用Cellpose自动分割后，SomaFRCaMPi可识别神经元数量较FRCaMPi提升2倍。在细胞体定位和信号响应方面，SomaFRCaMPi细胞体与神经纤维的荧光比是非靶向指示剂的两倍以上，且在逼近视觉刺激下，其峰值 ΔF/F0 和信噪比（SNR）显著优于其他指示剂，且神经纤维信号响应降低了3倍。这些结果展现了SomaFRCaMPi在斑马鱼钙成像中对神经元群体中胞体信号提取的显著应用优势。（图5）
图5 jRGECO1a、FRCaMPi和SomaFRCaMPi在斑马鱼神经元中的表达和表征
后续，作者利用双光子显微镜对小鼠初级视觉皮层（V1）神经元群体进行了钙成像。SomaFRCaMPi 在细胞体定位上表现出色，能够显著减少神经纤维的荧光干扰，而SomajRGECO1a则体现出明显毒性。视觉光栏刺激下，SomaFRCaMPi载L2/3层中检测到的平均神经元数量（58.1 neurons/FOV）较jRGECO1a（21.9 neurons/FOV）提升2.6倍。与 jRGECO1a 相比，SomaFRCaMPi 的峰值 ΔF/F0 幅度高出至少 77%，总体响应细胞数增加了50%。信号相关性（Pearson系数）在未校正神经纤维信号时降低2-7倍（不同距离范围上）。此外，SomaFRCaMPi 在长期表达（4个月）后仍能保持较高的灵敏度和稳定的信噪比。同时在深层皮层(L5)，SomaFRCaMPi也体现了类似的高峰值和低信号相关性。由此可见，SomaFRCaMPi 能够在深部脑区实现高灵敏度、高信号提取和低神经纤维干扰的稳定神经元活动检测，是双光子在体成像的高性能红色GECI。（图6）
图6 小鼠V1皮层的体内神经群体成像
为了进一步评估 SomaFRCaMPi 是否能够与高性能绿色探针相匹敌，作者将 SomaFRCaMPi 与绿色胞体定位的 RiboL1-GCaMP8s（已知灵敏度最高的绿色GECI之一）共同表达于小鼠脑干孤束核（NTS）。在消化道扩张刺激下进行双色双光子成像结果表明，SomaFRCaMPi 在该高密度神经元区域依旧保持了清晰的群体荧光信号，且噪声水平更低，Z-score 信噪值与RiboL1-GCaMP8s近乎一致。这意味着 SomaFRCaMPi 的灵敏度已经可以比肩最好的绿色胞体定位GECI，并充分体现了利用红色波段的成像优势。（图7）
图7 胃扩张期间NTS调谐的双色体内钙成像
最后，作者在清醒小鼠的初级体感皮层（S1）和视觉皮层（V1）中利用单光子宽场显微镜测试了 SomaFRCaMPi 的性能，并发现其相较于 FRCaMPi 在多个方面表现出显著优势：皮层神经元被高密标记时（80-90%），SomaFRCaMPi 能够检测到均值3.3倍于FRCaMPi的神经元ROI，同时SomaFRCaMPi观测到的钙事件数量较FRCaMPi增加50%，并且在峰值信噪比（SNR）上分别高出 10% 和 40%。更重要的是，在更高的神经元密度和平均更多钙事件的前提下，SomaFRCaMPi 仍能有效降低神经元间活动的相关性，尤其是在长距离（800 µm）范围内，相关性比 FRCaMPi 低20%-30%。这些结果表明 SomaFRCaMPi 在单光子宽场成像中的高效应用，降低了噪声，提升了检测数量以及信号的灵敏度和准确性。（图8）
图8 宽场成像记录S1和V1中FRCaMPi和SomaFRCaMPi的动态变化
研究人员通过拓扑结构反转和细胞体靶向策略重新设计了基于 mApple 的红色钙指示剂 FRCaMP，增加了与钙的亲和力并开发出 SomaFRCaMPi，其在小鼠和斑马鱼的神经元群体活动记录中表现出更高的灵敏度、信噪比和更低的信号相关性，性能与绿色胞体的GECIs 相当。SomaFRCaMPi 的开发提供了一种无需繁琐突变筛选即可增强灵敏度的新方法，同时强调了拓扑结构（将传统环状置换cp结构转化为ncp结构）在传感器优化与融合特定靶向上设计的潜力，为未来基于单荧光蛋白的 GECIs 提供了新的设计思路。
说明：目前文章已被PLOS Biology期刊接收。
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